Jest to prostokątne pomieszczenie o długości 40,93 m, szerokości 13,41 i wysokości 20,70 m. Przykrywa je sklepienie kolebkowe z lunetami. Dzieli je ażurowa balustrada wykonana przez Mino da Fiesole. Po prawej stronie pomieszczenia (patrząc w kierunku ołtarza) znajduje się kantoria z organami. Kaplica Sykstyńska słynęła z doskonałego, męskiego chóru, w którym śpiewali również mężczyźni obdarzeni wysokim kontraltem (stąd brały się nie zawsze prawdziwe informacje o śpiewie kastratów).